作者

肖飞武汉华扬动物药业有限责任公司

来源

腾氏水产商务网-当代水产

草鱼化学性肝损伤令人头疼，该如何保护？这份研究报告值得一看

金黄疏肝应激散小鼠经口急性毒性试验

为评价金黄疏肝应激散的安全性，受武汉华扬动物药业有限责任公司委托，根据农业部“兽药临床前毒理学评价试验指导原则”技术要求，对其提供的金黄疏肝应激散进行小鼠的经口急性毒性试验。

ICR小鼠40只，雌雄各半，采用最大耐受量测定法，进行经口灌服金黄疏肝应激散的急性毒性试验。结果表明，金黄疏肝应激散小鼠经口染毒，LD50大于5.0g/kgBW，最大耐受量大于10.0g/kgBW。根据WTO有关药物急性毒性分级标准评价，金黄疏肝应激散属实际无毒。

1材料方法

金黄疏肝应激散，批号：。由武汉华扬动物药业有限责任公司提供；羧甲基纤维素钠，国药试剂。

清洁级ICR小鼠，雌雄各半，体重18～22g，购于扬州大学比较医学中心，动物生产许可证号：SCXK（苏）-，使用许可证号：SYXK（苏）-。小鼠饲料由该中心提供，自由采食和饮水，试验前在实验动物房适应3天，试验给药前停食12h，不限制饮水。

精确称取试药12.5g，加入0.5%羧甲基纤维素钠溶液50ml，配制成0.25g/ml的混悬液备用（经预试证实，当金黄疏肝应激散浓度达0.3g/ml时，无法通过灌胃针灌胃给药）。

2方法

取8只小鼠（雌、雄各半）分为两组，每组4只，每组设2个重复，禁食12h后，取上述混悬药液，灌胃给药1次，灌胃给药体积2ml/g（相当于原生药mg/Kg）。给药后4h内连续观察，之后每天上午和下午分别由试验人员肉眼各观察1次，连续观察7d，结果小鼠全部存活，且精神、自主活动、采食、饮水、排便等正常。

按照农业部兽药评审中心《兽药研究技术指导原则汇编》之兽药急性毒性试验指导原则精神，将动物数增至10只，并重复2次试验。即又取20只小鼠（雌雄各半），再次进行灌胃给药1次，灌胃给药体积2ml/g，给药后4h内连续观察，之后每天上下午各观察1次，连续观察7d，结果小鼠全部存活，即受试药物金黄疏肝应激散的LD50大于mg/Kg，提示该受试物毒性很低，依据《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》（国家食品药品监督管理局编．中药、天然药物急性毒性试验技术指导原则GPT2-1[S]．．）改用最大耐受量给药试验。

ICR小鼠40只，随机分成2组，即阴性对照组和染毒组（试验组），每组20只，雌雄各半，试验前禁食不禁水12h。染毒组小鼠按2ml/gBW灌胃试药混悬液，间隔3h后重复灌胃给予等体积试药；阴性对照组灌胃给予等容积0.5%羧甲基纤维素钠溶液，给药后4h内连续观察，之后每天上午和下午分别由试验人员肉眼各观察1次，连续观察7d[2]。观察动物精神状态、毛色、自主活动、呼吸、饮食、二便、口鼻分泌物等一般状态，并详细记录动物的中毒表现和特点，毒性反应出现和消失的时间、死亡时间，观察期结束后将所有存活小鼠脱臼处死，进行眼观病理学检查。

3结果

染毒组ICR小鼠在2次按照给予2ml/gBW的试药混悬液，即10g/kg剂量经口染毒后的4h内，与阴性对照组小鼠相似，所有小鼠均存活，且精神、自主活动、采食、饮水、排便等正常，未出现中毒反应，便停止重复给药。7d观察期结束，所有小鼠均存活，之后采用颈椎脱臼处死存活小鼠，眼观病理学检查均未发现明显的病理变化。结果表明，金黄疏肝应激散小鼠经口染毒，LD50大于5.0g/kg；最大耐受量大于10.0g/kg。

4结论

根据WTO有关外源性药物急性毒性分级标准进行评价，试验结果表明金黄疏肝应激散属实际无毒。

金黄疏肝应激散亚慢性毒性试验

金黄疏肝应激散主要成分为郁金、姜黄、刺五加。具有保护鱼体肝脏，解除机体内有毒物质，促进机体正常代谢，提高鱼体抗应激能力的作用。为评价其用药安全性，受武汉华扬动物药业有限责任公司委托，根据农业部“兽药临床前毒理学评价试验指导原则”技术要求，对其提供的金黄疏肝应激散进行90d重复给药试验，80只Wistar大鼠随机分均为4组，受试药物分别以2.5g/KgBW，5.0g/KgBW，10g/KgBW混饲连续给药90天，观察和测定45d和90d各组大鼠的临床症状、体重、增重率、血常规、血液生化指标以及肝、肾、心、脾、肺等脏器系数和组织病理学变化。结果，试验组各项指标均在正常范围内，与对照组无显著差异。试验结果表明，在试验条件下，未发现金黄疏肝应激散对大鼠的生长发育产生不良影响，中长期连续给药无亚慢性毒性。

1材料与方法

金黄疏肝应激散，批号：，由武汉华扬动物药业有限责任公司提供。

6周龄清洁级Wistar大鼠80只，雌雄各半，体重公鼠在~g之间，母鼠在~g之间，由扬州大学比较医学中心提供。动物生产许可证号：SCXK（苏）-，使用许可证号：SYXK（苏）-。

将80只Wistar大鼠随机分为4组，分别为金黄疏肝应激散高、中、低剂量组和空白对照组，每组20只，雌雄各半。组内动物个体体重相差应不超过平均体重的20%，组间平均体重相差不超过5%。

由于急毒试验没有测出LD50，90天喂养试验的高剂量组按最大耐受剂量10g/Kg（根据90天喂养试验指导原则确定为靶动物摄入量的倍，靶动物推荐的摄入量为mg/kg，试验大鼠即mg/Kg×=10g/Kg），混饲给药，分为低，中，高剂量组及对照组。给药各组剂量分别定为：0.0g/KgBW，2.5g/KgBW，5.0g/KgBW，10g/KgBW，连续给药90天。

期间受试药物给予量按大鼠每日饲料摄入量折算为饲料中受试药物浓度。因此在喂养试验的前30天大鼠每日饲料摄入按体重的10%折算，即将金黄疏肝应激散分别按2.5%、5.0%和10.0%的浓度添加于由比较医学中心提供的大鼠全价饲料的原粉料中，经充分混匀后热挤压制成颗粒料喂养。在喂养试验的后60天大鼠每日饲料摄入按体重的8%折算，即将金黄疏肝应激散分别按3.%、6.25%和12.5%的浓度添加于大鼠全价饲料的原粉料中，经充分混匀后热挤压制成颗粒料供喂养。（注计算说明：高剂量组，大鼠1Kg的每日饲料摄入量为0g×10%＝g，大鼠1Kg应给予的金黄疏肝应激散剂量为10g，即1Kg大鼠每日摄入的g饲料中应添加金黄疏肝应激散10g。因此，折算成浓度百分比为10%，其他剂量类推。）

服药期间每天肉眼观察大鼠的一般行为（包括精神状态，行为活动，采食量，饮水量，毛色，对外反应，粪便等）、中毒及死亡情况；同时记录饮水量、采食量，并按周测量大鼠体重，投入饲料量和剩余饲料量。并计算平均摄食量、增重。将染毒剂量组与对照组加以比较和统计学处理，及时记录和分析大鼠的中毒症状及出现各症状的先后次序、时间。

在给药45天和90天结束时，各组随机抽取10只大鼠（雌、雄各半）采血进行血液学指标检测（包括血红蛋白、红细胞计数、白细胞计数和分类等）和血液生化指标检测（包括谷草转氨酶（AST或SGOT）、谷丙转氨酶（ALT或SGPT）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、血糖（GLu）、血清白蛋白（Alb）、总蛋白（TP）、总胆固醇（TCH）和甘油三脂（TG）等）。

于给药45天和90天试验结束，各组分别取10只大鼠（雌、雄各半）进行剖检（可结合采血进行）。做好记录，并将重要器官和组织固定保存。

剖检试验大鼠的同时，称取大鼠体重及各主要脏器（包括肝、肺、心、肾、脾、胃肠、睾丸/子宫等）重量，计算各脏器系数。

对高剂量组及对照组大鼠的主要脏器进行组织病理学检查，发现病变后再对较低剂量组大鼠的相应器官及组织进行检查。

数据以±SD表示，用SPSS应用软件进行组间数据的显著性检验。采用t检验比较试验组与对照组间的平均饲料摄入量、饮水量、增重和增重率、血液学和血液生化学等各项指标的显著性差异。

2结果

各组大鼠拌饲给药直至90d，均无死亡，期间精神、活动，采食行为、饮水行为、毛色、对外反应和粪便等临床表现正常，没有出现病理状态和死亡。

试验期间，每周对各组大鼠称重1次，统计周平均体重和周增重率。结果第1周高剂量组母鼠的周均增重率显著低于空白对照组（P＜0.05），其余各周各给药组母鼠的均重和周均增重率与空白对照组均无显著差异；第1～7周各给药组公鼠的均重都显著低于空白对照组（P＜0.05），第8～12周部分给药组公鼠的均重仍显著低于空白对照组（P＜0.05），但各给药组公鼠的周均增重率只有第1、2周显著低于空白对照组（P＜0.05），而第3周后各给药组公鼠的周均增重率与空白对照组均无显著差异，甚至有许多周还高于空白对照组的周均增重率，详细结果见表1。

引起这现象的原因是由于给各药组所给药物金黄疏肝应激散分别达到了饲料含量的2.5%、5.0%和10.0%（指导原则要求高剂量组应为靶动物摄入量的倍），从而一定程度上降低了饲料的能量、蛋白质和其他营养物质的含量和影响了适口性，因而造成饲料摄入量应该较多的公鼠在给药早期（第1、2周）采食量相对减少，体重增加亦较少。另外，从整个给药试验的前45d、后45d及90d的周均增重率来比较，所有试验给药的高、中、低剂量公、母鼠各组与空白对照组均无显著差异，说明在大鼠适应含药饲料后，金黄疏肝应激散对大鼠体增重没有大的影响。

试验结束时，各试验组公鼠的平均体重均比空白对照组低近30g，因为各组内标准差比较大，只有中剂量组的均重显著低于空白组（P＜0.05），低剂量组和高剂量组与空白组差异不显著。造成体重差异的原因，还是与各试验组公鼠的采食量比空白组低有关，整个试验期间空白组、低剂量组、中剂量组和高剂量组采食量分别为.69g、.76g、.04g、g，低剂量组的采食量最低，比空白组低近g，同时添加中药后饲料的能量和蛋白质含量相应降低，导致各试验组大鼠试验结束后体重比空白组低很多；因为添加更多的中药中剂量组和高剂量组饲料的能量和蛋白质比低剂量组的更低，但是这两组的采食量比低剂量的高、高剂量组的采食量比中剂量组的高，所以这三组的增重比较接近。

表1对大鼠体重的影响（n=10）

注：同行数据上标字母不同且相邻者差异显著（P＜0.05），相间者差异极显著（P＜0.01）。下类同。

试验期间对各组大鼠的采食量和饮水量进行统计分析，结果显示：除第1周各给药组公鼠的采食量显著低于空白对照组（P＜0.05，这与大鼠对含药饲料的适应性有关），各给药组母鼠的采食量略低于空白对照组外，其余各周各给药组公母鼠的采食量和饮水量与空白对照组相比均无显著差异（P＞0.05），详细结果见表2。说明在大鼠适应含药饲料后，金黄疏肝应激散对大鼠的采食量和饮水量没有明显影响。

表2对大鼠采食量、饮水量的影响（n=10）

连续给药45d和90d后，对各组一半大鼠的血液学指标和血液生化指标分别进行了检测统计分析，结果显示：各剂量组的血液学指标和血液生化指标测定值与对照组相比均无显著性差异（P＞0.05），详细结果见表3、表4。说明金黄疏肝应激散按高、中、低剂量混饲连续给药90d，对大鼠血常规和血液生化指标未造成影响。

表3连续投喂45d对Wistar大鼠血液学及血液生化参数的影响（n=10）

表4连续投喂90d对Wistar大鼠血液学及血液生化参数的影响（n=10）

连续给药45d和90d后，各组分别取一半大鼠扑杀，剖检观察、称量主要脏器，统计分析各脏器系数。结果显示：所有给药组的各器官脏器系数与空白对照组相比均无显著差异（P＞0.05），详细结果见表5。说明金黄疏肝应激散按高、中、低剂量混饲连续给药90d，对大鼠的心、肝、脾、肺、肾、胃、睾丸/卵巢子宫的生长发育均没有影响。

表5对大鼠主要脏器系数的影响（n=10）

连续给药45d和90d后，各组分别取一半大鼠采血后扑杀，肉眼观察各组大鼠主要内脏器官，结果显示：给药的各剂量组和空白对照组大鼠的脏器均未发现异常病变。然后分别采集空白对照组和高剂量组大鼠的心、肝、脾、肺、肾、胃肠、睾丸或子宫组织用10%福尔马林溶液固定，制作石蜡组织切片，经HE染色，显微镜观察，亦未发现异常的组织病理学变化，详见附图。

3结果分析

连续给药90d金黄疏肝应激散各剂量组大鼠的增重率、摄食、血常规及血液生化指标与对照组相比，均未发生显著性变化（P＞0.05）；剖检和组织学观察肝、肾、心、脾、肺、睾丸或子宫等重要器官组织均未发现异常的组织病理学变化。

4结论

在试验条件下，未发现金黄疏肝应激散对大鼠的生长发育产生不良影响，90d连续给药无亚慢性毒性。体重的差异与采食量和摄入的能量及营养物质含量下降有关。

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